跑完一轮qPCR，仪器上二十八根曲线全是平的，只有内参正常。这种结果通常不是试剂坏了，而是循环条件没设对。聚合酶链式反应，也就是PCR，本质是让一段DNA在试管里反复复制，靠三个温度来回切换完成。

95度那一步不是随手写的

变性温度95度，保持15到30秒，把双链DNA拆成两条单链。温度低了拆不开，温度高了时间长了，Taq酶活性会掉。老式PCR仪升降温慢，模块实际温度常比设定低两三度，设94度反而更稳。

退火温度决定特异性

降到55度左右，引物贴到模板上。这个值一般按引物Tm减5度来定。设高了引物贴不上，扩增效率低；设低了到处乱贴，跑胶能看到一串杂带。引物GC含量高的时候55度就偏低，先用温度梯度摸一遍条件。

72度负责往下延伸

Taq酶最适温度72度，速度大约每分钟一千个碱基。目的片段两百bp，30秒够用；超过一千五百bp，要换高保真酶并把时间延到一分半以上。循环数一般30到35，再多就进平台期，非特异性产物也跟着上来。

模板和引物比温度更容易出岔子

模板加太多，体系里的杂质和抑制物一起进去，扩增反而变差。基因组DNA一般用到十到一百纳克，质粒按拷贝数折算。两条引物浓度差太多，低的那条先耗尽，后面十几个循环基本白跑。

配好体系先短暂离心，把挂壁的液体甩下去，气泡会影响荧光采集。qPCR板封膜要贴平，边缘孔受温度不均影响最明显，上机前用板式离心机转一圈。

污染比条件不匹配更常见

同一间实验室长期做大量扩增，气溶胶飘在空气里，开盖那一下就可能落进管里。阴性对照如果也出条带，说明试剂或环境被污染，这一批数据只能作废。分区分装、勤换枪头、开盖前离心，这些都是老实验室踩坑踩出来的规矩。

扩不出来，先看引物有没有二聚体，再调退火温度，然后才怀疑模板。别人的参数照抄经常不灵，条件得自己摸。